Homocistein kao prediktor kliničkog ishoda pacijenata hospitalizovanih zbog COVID-19

Uvod: Covid-19 i dalje predstavlja zdravstveni, socijalani i ekonomski problem na svetskom nivou. Lečenje ove sistemske infekcije je još uvek izazov. Izučavani su brojni biomarkeri u pravcu potencijalnih prognostičkih parametara, a u najvećoj meri hematološki i parametri inflamacije.

Cilj: Naš glavni cilj je da ispitamo povezanost vrednosti homocisteina sa ishodom bolesti, kao i to da li se njegova vrednost menja tokom bolesti.

Materijal i metode: U našem istraživanju prikupljeni su uzorci krvi 131 pacijenta koji su svi bili pozitivni na SARS-CoV-2 i lečeni hospitalno u UKC Kragujevac. Uključujući kriterijumi su bili sledeći: muškarci i žene stariji od 18 godina, potpisan informisani pristanak za učešće u studiji, prvi put pozitivni na SARS-CoV-2 (brzi Ag test ili PCR test), leče se hospitalno i imaju bilo koju od tri forme bolesti. Krv je uzorkovana prvog, petog i desetog dana hospitalizacije i praćen je tok bolesti. Statistička obrada podataka urađena je korišćenjem programa IBM SPSS Statistics v.21.

Rezultati: Zaključili smo da se vrednost homocisteina menja tokom hospitalizacije, odnosno da ima trend rasta. Postoji statistička značajnost između vrednosti merenih prvog, petog i desetog dana. Pokazali smo da pacijenti koji boluju od hipertenzije (HTA), imaju više vrednosti ispitivanog parametra u odnosu na pacijente koji nisu hipertoničari. Uočeno je i da vrednost homocisteina raste sa godinama. Pokazana je satistička značajnost između vrednosti homocisteina i ishoda bolesti.

Zaključak: Na osnovu naše studije možemo reći da pacijenti kod kojih je izmerena visoka vrednost homocisteina (petog dana hospitalizacije) imaju lošiji ishod bolesti u odnosu na pacijente sa nižim vrednostima ovog markera. Pacijenti sa nižim vrednostima homocisteina imaju veće šanse za oporavak.

UVOD

Krajem 2019. godine, novi virus pod nazivom SARSCoV-2 identifikovan je kao uzročnik pneumonije u kineskom gradu Vuhanu, a marta 2020. godine Svetska zdravstvena organizacija (SZO) proglasila je stanje pandemije i bolest nazvala koronavirusna bolest 2019 [1]. Bolest se prema kriterijumima SZO iz septembra 2022. godine klasifikuje u tri forme: kritična (eng. critical COVID-19), ozbiljna (eng. severe COVID-19) i blaga (eng. mild COVID-19) [2]. Infekcija je povezana sa rizikom od tromboembolijskih događaja u čijoj osnovi su inflamacija, endotelitis, hiperviskoznost i hiperkoagulabilnost [3]. U literaturi se može pronaći veliki broj istraživanja koja su pokazala visoku incidencu venske tromboembolije kod pacijenata sa teškom kliničkom slikom Covid-19, uprkos primeni tromboprofilakse [4],[5]. Ovi pacijenti mogu razviti infarkt miokarda, cerebrovaskularne događaje, arterijsku trombozu ili mikrotrombozu više organa, uključujući i pluća [6]. Koagulopatija je označena kao loš prognostički parametar i zbog toga je tromboprofilaksa savetovana kod svih pacijenata gde ne postoji jasna kontraindikacija [3]. Sprovedene su brojne studije gde je ispitivan i praćen veliki broj markera koji jesu ili mogu biti prediktori prognoze, toka i ishoda ove bolesti [4]. Ispitivani su mnogi parametri inflamacije, kao i brojni imunološki, hematološki i biohemijski parametri [7]. Jedan od ispitivanih biomarkera jeste aminokiselina homocistein, koji od kada je otkriven izaziva veliko interesovanje i predmet je brojnih istraživanja [8],[9]. Homocistein je semiesencijalna, sulfhidrilna aminokiselina koja nastaje od esencijalne aminokiseline metionina, ne ulazi u sastav peptida i proteina, i ne unosi se preko hrane [7],[8]. Metabolizam homocisteina podrazumeva proces metilacije i transsulfuracije. Za proces metilacije neophodni su vitamin B12, folna kiselina, kao i enzim metiltetrahidroksifolat reduktaza (MTHFR), dok je za proces transsulfuracije potreban vitamin B6 i enzim cistation β-reduktaza [6],[10]. Poremećaj metabolizma homocisteina najčešće dovodi do hiperhomocisteinemije koja se definiše kao vrednost homocisteina iznad 15µmol/l [6]. Refsum i sar. su među prvima sproveli veliko istraživanje, na populaciji od preko 18000 ispitanika pri čemu je zaključeno da je hiperhomocisteinemija povezana sa povećanim rizikom od hospitalizacije kod kardiovaskularnih bolesnika, i to u većem procentu kod osoba starijih od 65 godina. Van der Meer i sar. su došli do podatka da je hiperhomocisteinemija povezana sa povećanim rizikom od tromboze [11]. Osim ove povezanosti u literaturi se opisuje i rizik od još nekih oboljenja među kojima su: cerebrovaskularna oboljenja, neurodegenerativna oboljenja, komplikacije u trudnoći, osteoporoza, maligne bolesti, ali i teža klinička slika i loš ishod obolelih od Covid-19 [8],[9]. Tri najveće studije o povezanosti Covid-19 i vrednosti homocisteina sprovedene su u Italiji, Kini i Turskoj što je u junu 2022. godine iskorišćeno za meta-analizu, pri čemu se kod ukupno 694 hospitalno lečena pacijenta povišena vrednost homocisteina u serumu pokazala kao loš prognostički znak [6]. Yang i sar. su u svoje istraživanje uključili 273 pacijenta kojima su merili nivo homocisteina prvog dana hospitalizacije uz ostalu propratnu dijaganostiku koja je uključivala CT grudnog koša, a zatim je posle 5-7 dana vršena procena progresije bolesti ponavljanjem CT-a. Pacijenti koji su imali više vrednosti homocisteina na prijemu imali su i progresiju na CT nalazu [12]. Ponti i sar. sproveli su istraživanje na 304 pacijenta gde su merili nivo homocisteina u plazmi prilikom prijema u bolnicu, i pokazali su da je nivo ove supstance bio viši kod pacijenata čije se lečenje završilo smrtnim ishodom [10]. Keskin i sar. su izmerili homocistein u plazmi 117 pacijenata, takođe prilikom prijema, podelivši ih u dve grupe (blaga i teška forma bolesti), i pokazalo se da su pacijenti sa teškom formom bolesti imali viši nivo homocisteina u odnosu na pacijente sa blagom formom [13].

Cilj: Hiperkoagulabilnost i sklonost ka trombozi kod obolelih od Covid-19 privlači veliku pažnju. Sprovedene su studije koje ispituju veliki broj markera hemostaze. U našem istraživanju ispitivali smo parametar koji se ne analizira u rutinskoj praksi već uglavnom kod pacijenata sa sumnjom na stečenu trombofiliju. Odlučili smo da ga analiziramo kroz vreme, odnosno u nekoliko navrata tokom hospitalnog lečenja pacijenata obolelih od Covid-19. Naš glavni cilj je da ispitamo povezanost vrednosti homocisteina sa ishodom bolesti, te da utvrdimo da li se njegova vrednost menja tokom trajanja bolesti.

MATERIJAL I METODE

Uzorkovnje

U našem istraživanju prikupljeni su uzorci krvi 131 pacijenta koji su zbog SARS-CoV-2 infekcije hospitalno lečeni u UKC Kragujevac. Uključujući kriterijumi su bili sledeći: muškarci i žene stariji od 18 godina, potpisan informisani pristanak za učešće u studiji, prvi put pozitivni na SARS-CoV-2 (brzi antigenski test ili PCR test), leče se hospitalno i imaju bilo koju od tri forme bolesti definisane kriterijumima SZO. Krv je uzorkovana prvog, petog i desetog dana hospitalizacije i praćen je tok bolesti. Uzorkovana je jedna epruveta (3ml krvi). Analiza je rađena u hematološkoj laboratoriji Klinike za hematologiju UKC Kragujevac na standardizovanom aparatu. Od 131 ispitanika bilo je 53 žene (40,5%) i 78 muškaraca (59,5%). Ispitanici su imali od 19 do 90 godina pri čemu je prosečna starost iznosila 62,3±16,3 godina.

Statistička obrada podataka

Statistička obrada podataka urađena je korišćenjem programa IBM SPSS Statistics v.21. Normalnost raspodele podataka analizirana je korišćenjem Kolmogorov-Smirnov testa normalnosti. Za analizu vrednosti homocisteina izmerenih prvog, petog i desetog dana korišćen je Fridmanov test. Za analizu vrednosti homocisteina izmerenih prvog, petog i desetog dana u odnosu na kategorijske promenljive sa dva odgovora korišćen je t-test za nezavisne uzorke ukoliko su podaci po kategorijama pratili normalnu raspodelu i Man-Vitnijev U test ukoliko podaci po kategorijama nisu pratili normalnu raspodelu. Za analizu vrednosti homocisteina izmerenih prvog, petog i desetog dana u odnosu na kategorijske promenljive sa više od dva odgovora korišćena je jednofaktorska ANOVA za različite grupe ukoliko su podaci po kategorijama pratili normalnu raspodelu i Kruskal-Volisov test ukoliko podaci po kategorijama nisu pratili normalnu raspodelu. Za analizu vrednosti homocisteina izmerenih prvog, petog i desetog dana u odnosu na numeričku promenljivu (starost ispitanika) korišćen je metod korelacije i regresije, odnosno tumačena je vrednost Spirmanovog koeficijenta korelacije. Rezultati su smatrani statistički značajnim ukoliko je značajnost (p vrednost) bila manja ili jednaka 0,05.

REZULTATI

Za deskriptivnu statističku analizu neprekidnih promenljivih korišćene su najmanja i najveća vrednost kao i prosečna vrednost i standardno odstupanje. Rezultati ove analize prikazani su u Tabeli 1.

Tabela 1. Deskriptivne vrednosti homocisteina tokom trajanja bolesti

Za deskriptivnu statističku analizu kategorijskih promenljivih korišćene su apsolutna i relativna učestalost. Rezultati ove analize prikazani su u Tabeli 2.

Tabela 2. Deskriptivna statistička analiza uzorka pacijenata

Za analizu vrednosti homocisteina izmerenu prvog, petog i desetog dana korišćen je Fridmanov test. Primenom Fridmanovog testa utvrdili smo da postoji statistički značajna razlika (Chi-Square statistics=45,319, df=2, p < 0,001) u vrednostima homocisteina izmerenih u tri različita trenutka. Da bismo utvrdili između kojih konkretno trenutaka postoji statistički značajna razlika, za naknadne testove korišćen je Vilkoksonov test. Primenom Vilkoksonovog testa utvrdili smo da postoji statistički značajna razlika u vrednostima homocisteina između sva tri merenja. Grafički prikaz ovog rezultata predstavljen je na Grafikonu 1.

Grafikon 1. Vrednosti homocisteina tokom hospitalizacije

Za analizu vrednosti homocisteina u odnosu na pol ispitanika korišćen je Man-Vitnijev U test. Primenom ovog testa utvrdili smo da ne postoji statistički značajna razlika u vrednostima homocisteina izmerenih prvog, petog i desetog dana u odnosu na pol ispitanika. Za analizu povezanosti vrednosti homocisteina izmerenih prvog, petog i desetog dana i starosti ispitanika korišćen je metod korelacije i regresije, odnosno tumačena je vrednost Spirmanovog koeficijenta korelacije. Primenom metoda korelacije, odnosno tumačenjem vrednosti Spirmanovog koeficijenta korelacije, utvrdili smo da postoji umereno slaba, pozitivna i statistički značajna povezanost između vrednosti homocisteina izmerenih petog dana i starosti ispitanika. Rezultati ove analize prikazani su u Tabeli 3.

Tabela 3. Značajnost vrednosti homocisteina izmerenih petog dana hospitalnog lečenja u odnosu na starost, ishod bolesti i prisustvo hipertenzije

Za analizu vrednosti homocisteina u odnosu na ishod bolesti ispitanika korišćen je t test za nezavisne uzorke. Primenom t testa za nezavisne uzorke utvrdili smo da ne postoji statistički značajna razlika u vrednostima homocisteina izmerenih prvog i desetog dana u odnosu na ishod bolesti ispitanika, ali da postoji u odnosu na vrednosti izmerene petog dana. Rezultati su prikazani u Tabeli 3 i na Grafikonu 2.

Grafikon 2. Prosečna vrednost homocisteina u V danu u odnosu na ishod bolesti

Za analizu vrednosti homocisteina u odnosu na formu bolesti ispitanika korišćen je Kruskal-Volisov test. Primenom Kruskal-Volisovog testa utvrdili smo da ne postoji statistički značajna razlika u vrednostima homocisteina izmerenih prvog, petog i desetog dana u odnosu na formu bolesti ispitanika. Za analizu vrednosti homocisteina u odnosu na prisustvo hipertenzije kod ispitanika korišćen je Man-Vitnijev U test. Utvrdili smo da postoji statistički značajna razlika u vrednostima homocisteina izmerenih petog dana u odnosu na prisustvo hipertenzije kod ispitanika. Rezultati ove analize prikazani su u Tabeli 3. Značajno više vrednosti homocisteina izmerene petog dana imaju ispitanici sa hipertenzijom. Grafički prikaz vrednosti homocisteina izmerenih petog dana u odnosu na prisustvo hipertenzije kod ispitanika predstavljen je na Grafikonu 3.

Grafikon 3. Vrednost homocisteina u V danu u odnosu na prisustvo hipertenzije

DISKUSIJA

Do sada su u literaturi analizirane vrednosti homocisteina prilikom prijema pacijenta u cilju korelacije sa ishodom i kliničkom slikom [6]. U našoj studiji pratili smo vrednosti homocisteina kroz dane hospitalizacije, odnosno kroz tok bolesti. Uzorkovana je krv prvog dana hospitalizacije, zatim petog i desetog dana. Uključili smo 131 pacijenta oba pola (53 žene i 78 muškaraca) sa sve tri fome bolesti. Ispitanici su imali od 19 do 90 godina pri čemu je prosečna starost iznosila 62,3±16,3 godina. Blagu formu bolesti imalo je 29 pacijenata (22,1%), ozbiljnu 77 (58,8%), a kritičnu 25 pacijenata (19,1%). Na kućno lečenje otpušteno je 111 pacijenata (84,7%), dok je kod 20 pacijenata ishod bio letalan (15,3%). Zbog velikog broja istraživanja o povezanosti homocisteina i kardiovaskularnih bolesti pacijente smo podelili i na osnovu prisustva HTA [13],[14]. 104 pacijenta je bolovalo od HTA (79,4%), a 27 nije imalo HTA (20,6%). Dosadašnja istraživanja pokazala su da postoji povezanost između povišenih vrednosti homocisteina prvog dana hospitalizacije i težine kliničke slike, kao i ishoda bolesti. Viši nivo homocisteina registrovan je kod pacijenata sa teškom formom bolesti u odnosu na pacijente sa lakšom formom, kao i kod pacijenata sa smrtnim ishodom u odnosu na one koji su se oporavili [10],[11]. Takođe, više vrednosti povezane su i sa progresijom bolesti na CT-u [10]. U našoj studiji pokazana je statistička značajnost izmerenih vrednosti homocisteina analiziranih kroz vreme, tačnije tokom bolesti vrednost se povećavala. Najniža izmerena vrednost homocisteina prvog dana iznosi 2,82, a najviša 29,4 (prosečna vrednost 7,49, standardno odstupanje 4,80). U petom danu najniža izmerena vrednost je 4,86, a najviša 29,52 (prosečna vrednost 8,07, standardno odstupanje 3,45). Utvrdili smo da postoji statistička značajnost između vrednosti homocisteina izmerenih petog dana hospitalizacije i ishoda bolesti (p < 0,05). Pacijenti kod kojih se bolest završila smrtnim ishodom imali su značajno više vrednosti ovog biomarkera petog dana hospitalizacije u odnosu na pacijente koji su se oporavili. Primetili smo da pacijenti koji boluju od HTA imaju više vrednosti homocisteina od pacijenata koji nisu hipertoničari. Postoji statistički značajna razlika u vrednostima homocisteina izmerenih petog dana u odnosu na prisustvo hipertenzije kod ispitanika (p < 0,05). Takođe, primećeno je da vrednost ispitivanog parametra raste sa starošću ispitanika. Postoji statistički značajna povezanost između vrednosti homocisteina izmerenih petog dana i starosti ispitanika (p < 0,05). Kao najznačaji podatak pokazala se vrednost homocisteina izmerena petog dana, koja je statistički značajno povezana sa ishodom bolesti, prisustvom hipertenzije i starošću ispitanika.

ZAKLJUČAK

Iz naše studije možemo zaključiti da se vrednosti homocisteina kod pacijenta lečenih hospitalno od Covid-19 menjaju tokom bolesti, odnosno da se vrednost povećava. Pokazali smo da vrednosti homocisteina izmerene petog dana značajno utiču na ishod lečenja. Pacijenti oboleli od Covid-19 kod kojih su izmerene više vrednosti homocisteina imaju lošiji ishod bolesti, odnosno veću šansu za smrtni ishod. Pacijenti sa nižim vrednostima homocisteina imaju bolju prognozu i brži oporavak.