Poređenje PD-L1 ekspresije u citološkom i histološkom materijalu seroznog high-grade karcinoma jajnika

Uvod: Tumorske ćelije u peritonealnom lavatu eksprimiraju različite proteine sa značajnim prognostičkim i terapijskim potencijalom. Takva ekspresija se može razlikovati od ekspresije u primarnom tumoru ili u metastazama. U ovoj studiji upoređivali smo ekspresiju PD-L1 markera (programirani ligand ćelijske smrti-1) na karcinomskim ćelijama jajnika u citološkom materijalu, u peritonealnim metastazama i u primarnom tumoru.

Materijali i metode:  Studija je obuhvatila 30 pacijentkinja koje su operisane zbog high-grade seroznog karcinoma jajnika (HGSC) u IIIC FIGO stadijumu tumorske bolesti, u jednogodišnjem periodu. Formirani su citoblokovi, citološki i tkivni mikronizovi koji su imunohistohemijski bojeni PD-L1 antitelom. Četiri kategorije PD-L1 ekspresije su: negativna, slaba, umerena i jaka ekspresija. Udružene umerena i jaka ekspresija smatrane su visokom PD-L1 ekspresijom.

Rezultati: Umerena ekspresija je najčešći obrazac PD-L1 ekspresije u primarnom HGSC (50%) kao i u peritonealnim metastazama (omentumu) (60%). Citološki uzorci su uglavnom pokazivali slabu PD-L1 ekspresiju (57%). Statistička analiza nije pokazala značajnu razliku među analiziranim grupama kada je reč o PD-L1 ekspresiji. Pokazana je pozitivna korelacija PD-L1 ekspresije između različitih, udruženih tumorskih uzoraka kod svakog pacijenta sa statisičkom značajnošću (p < 0,05) između svih analiziranih uzoraka.

Zaključak: PD-L1 ekspresija je dovoljno slična u svim analiziranim uzorcima tumora. To bi moglo ukazati na slične peritumorske regulatorne mehanizme HGSC primarnog tumora i tumorskog okruženja citološkog materijala. Imunohistohemijska analiza na formiranim citoblokovima pokazuje zadovoljavajuću pouzdanost određivanja ekspresije PD-L1 markera na karcinomskim ćelijama jajnika izolovanim iz citološkog materijala.

UVOD

Karcinom jajnika nalazi se na osmom mestu po učestalosti među karcinomima ženskih polnih organa [1]. Maligni ascites kod žena je česta posledica karcinoma jajnika [2]. Određivanje stadijuma tumora obično predstavlja indikaciju za postupak peritonealne lavaže. Prema Međunarodnoj federaciji ginekologa i opstetičara (FIGO), u I i II stadijumu, učestalost prisustva malignih tumorskih ćelija u peritonealnom lavatu iznosi 7%, dok je u slučaju III i IV stadijuma to čitavih 89% [3],[4]. High-grade serozni karcinom jajnika (HGSC) je najčešći maligni tumor ženskih polnih organa sa prisustvom malignih tumorskih ćelija u peritonealnom lavatu [3].

Ligand programirane ćelijske smrti1 (PD-L1) je molekul sa heterogenom ekspresijom koja nije karakteristična samo za tumorske ćelije [5],[6]. U ovom istraživanju analizirali smo ekspresiju PD-L1 na ćelijama high-grade karcinoma jajnika, uzimajući u obzir različite tipove uzoraka. Jedna od najznačajnijih imunosupresivnih interakcija jeste interakcija proteina PD-L1 u tumorskim ćelijama sa PD-1 molekulom na površini T-limfocita. Ovaj odnos dovodi do supresije T ćelija i inaktivacije njihovih efektorskih funkcija [5],[6],[7].

Peritonealni izliv kod karcinoma jajnika ima imunosupresivni efekat. Ranije studije su pronašle razne imunosupresivne faktore u uzorcima malignog ascitesa [2],[8]. Molekuli PD-1 i PD-L1 su svakako prisutni u malignom peritonealnom izlivu i mogu biti od značaja kao potencijalni prognostički i terapijski markeri [8].

Tumorsko tkivo u omentumu ukazuje na uznapredovali stadijum karcinoma jajnika i agresivnije biološko ponašanje. Omentum verovatno ima lošiji anti-tumorski imunski odgovor nego primarni tumor. Takve tumorske ćelije su često manje diferencirane u poređenju sa primarnim tumorom [9].

U ovoj studiji poredili smo ekspresiju PD-L1 na tumorskim ćelijama u citološkom materijalu peritonealnog lavata, peritonealnih metastaza, i primarnog HGSC.

MATERIJALI I METOD

Učesnici

Studija je zamišljena kao studija preseka koja obuhvata pacijentkinje prethodno operisane zbog high-grade karcinoma jajnika tokom perioda od jedne godine na Klinici za ginekologiju i akušerstvo Univrzitetskog kliničkog centra Srbije. Odabrali smo 30 pacijentkinja sa HGSC u IIIC FIGO stadijumu tumorske bolesti, sa peritonealnim metastazama i peritonealnim lavatom za imunohistohemijsko ispitivanje.

Prikupljanje i obrada materijala

Svi citološki uzorci (5ml) su centrifugirani 10 minuta na 1800 obrtaja/min. Parafinski blokovi su dobijeni plazma-trombin metodom [10]. Centrifugiranim uzorcima najpre smo dodali 0,5 ml plazme. U narednom koraku, dodali smo 0,3 ml trombina i epruvete su ostavljene na temperaturi od 37°C. Odmah se stvorio ugrušak. Ugrušak je prebačen u vrećicu za tkivo, fiksiran u rastvoru formalina, i podvrgnut rutinskoj histološkoj proceduri kao i uzorci uzeti iz primarnog tumora i metastaza. Odabran je reprezentativan citoblok za sva tri slučaja radi dalje imunohistohemijske analize.

Tkivni i citološki mikronizovi

Prema pravilima koja se odnose na tkivne i citološke mikronizove, uzorci cilindara su uzeti iz svakog parafinskog bloka uz pomoć igle dijametra 3mm. Tkivni cilindar je deo uzorka sa najvećim udelom tkiva. Uzimali smo u obzir žarišta sa više od 50 tumorskih ćelija radi adekvatne procene. Cilindri tumorskog tkiva uzeti sa mesta primarnog tumora i metastaza sadržali su najhomogenije vitalne delove tumora, sa najmanjim stepenom nekroze. Cilindri su potom premešteni u recipijentne parafinske blokove i formiran je niz mikro uzoraka. Tkivo placente je korišćeno za unutrašnju kontrolu imunohistohemijske analize i orijentacije blokova [11],[12].

Imunohistohemijska analiza

Imunohistohemijsko bojenje je obavljeno uz pomoć instrumenta Autostainer Link 48, Agilent (Danska), na Institutu za patologiju Medicinskog fakulteta u Belgradu. Za imunohistohemijsku analizu korišćeno je PD-L1 antitelo (klon 22C3) i sistem za vizualizaciju EnVision FLEX K8023. EnVision FLEX solution pH 6,1, K8005, Agilent, korišćen je za demaskiranje epitopa. Kao primarno antitelo, korišćeno je monoklonsko, antihumano M3653, Agilent, u razblaženju 1:30. Imajući u vidu imunoskor PD-L1, definisali smo četiri kategorije PD-L1 ekspresije na primarnom tumoru i metastatskom tkivu: negativnu (bez pozitivnih ćelija/sa jednom pozitivnom ćelijom (30 cells). Poredili smo ekspresiju PD-L1 u različitim uzorcima (metastaze, peritonealni lavat) svakog tumora. PD-L1 ekspresija u različitim uzorcima bila je u korelaciji sa dostupnim histopatološkim i kliničkim parametrima [14].

STATISTIČKA ANALIZA

Statistička analiza je sprovedena primenom deskriptivnih statističkih metoda i odgovarajućih statističkih testova (Studentov t-test, Fišerov egzaktni test, Man-Vitnijev test, Kruskal-Valisov test, ANOVA) za nivo značajnosti 0,05 uz upotrebu SPSS21 za Windows. Poređenje ekspresije PD-L1 među različitim uzorcima tumora rađeno je uz pomoć Spirmanove korelacije (r_s).

REZULTATI

Ekspresija PD-L1 u primarnom high-grade seroznom karcinomu jajnika

Prosečna starost pacijentkinja u ovoj posmatranoj grupi bila je 57,5±10,14 godina. Umerena ekspresija bila je najzastupljenija kategorija ekspresije PD-L1 u primarnom HGSC (50%). Jedna trećina (33%) primarnih tumora imala je slabu ekspresiju. Jaka ekspresija PD-L1 i odsustvo ekspresije PD-L1 bili su manje uobičajeni, uz sličnu frekventnost (Slika 1).

Slika 1. Učestalost kategorije PD-L1 ekspresije u primarnom high-grade seroznom karcinomu jajnika

Visoka PD-L1 ekspresija (udružene umerena i jaka ekspresija) bila je prisutna u 18 (60%) primarnih tumora. Klinički podaci i veličina tumora u grupama sa visokom i slabom ekspresijom PD-L1 dati su u Tabeli 1.

Tabela 1. Categories od PD-L1 expression according to clinical parameters and tumor size

Nije bilo statistički značajne razlike u PD-L1 ekspresiji u odnosu na menopauzalni status (p = 0,741 Fišerov test). Prosečna veličina tumora se nije značajno razlikovala u odnosu na PD-L1 ekspresiju u tumorskim ćelijama primarnog HGSC (p = 0,864 Kruskal-Valisov test).

Ekspresija PD-L1 u peritonealnim metastazama

PD-L1 ekspresija u peritonealnim metastazama (omentumu) najčešće (60%) je bila umerena (18 pacijenata). Osam uzoraka (27%) imalo je jaku ekspresiju, dok su preostale PD-L1 kategorije imale nisku frekventnost.

Prosečna starost pacijentkinja sa visokom PDL1 ekspresijom u peritonealnim metastazama bila je 64,9±10,14 godina. Bilo je 23 pacijentkinje u menopauzi (88%). U grupi pacijentkinja sa visokom PD-L1 ekspresijom u peritonealnim metastazama, srednja veličina primarnog HGSC bila je 40 mm (18-190 mm).

Nije bilo statistički značajne razlike u prosečnoj starosti pacijentkinja u odnosu na kategorije PD-L1 ekspresije u metastazama HGSC (p = 0,586 ANOVA), kao ni statitistički značajne razlike PD-L1 ekspresije u PD-L1 ekspresiji u odnosu na menopauzalni status pacijentkinja (p = 0,699 Fišerov test). Veličina primarnog tumora nije se značajno razlikovala u odnosu na PD-L1 ekspresiju u peritonealnim metastazama (p = 0,073 Kruskal-Valisov test). Nađena je statistički značajna razlika u veličini primarnog tumora između slabe i umerene PD-L1 ekspresije (p = 0,006 Man-Vitnijev test).

Ekspresija PD-L1 u citološkom matrijalu iz peritonealnog lavata

Adekvatna celularnost za analizu bila je prisutna kod 28 pacijentkinja. Slaba ekspresija nađena je u 16 uzoraka (57%), dok je 9 uzoraka (32%) imalo umerenu ekspresiju PD-L1. Nije bilo jake ekspresije u citološkom materijalu (Slika 2).

Slika 2. Učestalost kategorija PD-L1 ekspresije u peritonealnom lavatu

Prosečna starost pacijentkinja sa visokom PD-L1 ekspresijom bila je 64,9±10,31 godina. Većina ih je bila u menopauzi (89%). Prosečna veličina primarnog HGSC u odnosu na visoku PD-L1 ekspresiju u citološkom materijalu bila je 72.5 mm (18-190 mm).

Nije bilo statistički značajnih razlika u high-grade PD-L1 ekspresiji u odnosu na godine starosti (p = 0,938 ANOVA), menopauzalni status pacijentkinja (p = 0,699 Fišerov test), i prosečne veličine tumora (p = 0,132 Kruskal-Valisov test).

Korelacija PD-L1 ekspresije u različitim uzorcima high-grade karcinoma jajnika

Poređene su kategorije visoke PD-L1 ekspresije u omentumu (87%) i visoke PD-L1 ekspresije u primarnom HGSC (60%). Nije bilo statistički značajnih razlika. Ćelije karcinoma jajnika u peritonealnom lavatu imale su slabiju PD-L1 ekspresiju u poređenju sa tumorskim ćelijama u peritonealnim metastazama. Pri poređenju učestalosti umerenog nivoa ekspresije između ova dva uzorka nisu nađene statistički značajne razlike (12 vs.18; p = 0,273).

Imunohistohemijska analiza pokazala je raznovrsnu učestalost pozitivnosti na PD-L1 u različitim materijalima. Najučestalija kategorija ekspresije PD-L1 u primarnom HGSC i metastazama bila je umerena. U citološkom materijalu dominirala je slaba PD-L1 ekspresija (Slika 3).

Slika 3. Prikaz najčešćih kategorija PD-L1 ekspresije u primarnom HGSC (A) x100, (B) x400, u peritonealnim metastazama (omentumu) (C) x100, (D) x400, i u citološkom materijalu (E) x100, (F) x400

U ovom istraživanju analizirali smo korelaciju PDL1 ekspresije među različitim uzorcima tumora, koji su upareni prema pacijentkinjama, i pronašli smo statistički značajne rezultate među svim posmatranim grupama. Otkrili smo značajnu pozitivnu korelaciju u PD-L1 ekspresiji između primarnog HGSC i metastaza (p < 0,001; r_s = 0,620). PD-L1 ekspresija između primarnog HGSC i citoloških uzoraka takođe je pokazala postojanje pozitivne korelacije (r_s = 0,599), i to statistički značajne (p < 0,001). Kada je reč o metastazama, postoji pozitivna korelacija PD-L1 ekspresije u odnosu na citološke uzorke (r_s = 0,817), takođe statistički značajna (p < 0,001).

DISKUSIJA

Maligni ascites ima karakteristično tumorsko mikrookruženje sa različitim antitumorskim regulatornim mehanizmima koji mogu stimulisati proliferaciju tumorskih ćelija i njihovu sposobnost da metastaziraju. Različiti citokini, proinflamatorni i imuni faktori u peritonealnom izlivu menjaju imuni sistem domaćina. Brojni molekuli koji se eksprimiraju u peritonealnom lavatu imaju prognostički i terapijki značaj. Njihova ekspresija može se razlikovati od one u primarnom tumoru ili u metastazama [15].

Nema mnogo istraživanja koja se bave ekspresijom PD-L1 na citološkim uzorcima i njihovoj korelaciji sa ekspresijom PD-L1 u standardnim histopatološkim uzorcima. Aktuelna referentna udruženja (Papanicolaou Society of Cytopathology i Pulmonary Pathology Society) veoma su suzdržani po pitanju korišćenja citoloških preparata u svrhu istraživanja PD-L1 ekspresije. Zbog nedovoljnog broja radova i istraživanja u ovoj oblasti, kao i nedefinisanog načina interpretacije rezultata, kliničari i istraživači sumnjaju u pouzdanost ove analize [16]. Aktuelne studije porede nivoe ekspresije PD-L1 markera u histološkom i citološkom materijalu na tkivu karcinoma pluća [17].

Naše istraživanje se zasniva na analizi razlika u PDL1 ekspresiji u ćelijama karcinoma jajnika koje su smeštene u različitim tumorskim mikrookruženjima. Pošto većina uzoraka primarnog tumora pokazuje visoku ekspresiju PD-L1, smatra se da je PD-L1 regulatorni mehanizam u značajnoj meri aktivan u HGSC. Potvrdili smo da je visoka ekspresija PD-L1 povezana sa lošijom diferencijacijom ćelija karcinoma jajnika (trećeg stepena) i sa uznapredovalim stadijumom karcinoma (FIGO IIIC).

U našoj studiji, PD-L1 ekspresija na ćelije karcinoma jajnika iz peritonealnog lavata pokazala je neke razlike u frekventnosti ekspresije u poređenju sa primarnim tkivom kancera. Manji broj pacijentkinja (32%) imao je visoku PD-L1 ekspresiju na tumorske ćelije u peritonealnom lavatu nego što je to bio slučaj sa primarnim tumorom (60%). Slabija ekspresija PD-L1 markera na tumorske ćelije u peritonealnom lavatu može se objasniti dodatnim imunoregulatornim mehanizmima koji svakako utiču na tumorsko mikrookruženje. Pretpostavlja se da su ovi mehanizmi različito regulisani u peritonealnom lavatu u odnosu na primarno tumorsko tkivo. Signalni putevi kao što su LAG-3 (limfocitni aktivacioni gen 3) i TIM 3 ( T ćelijski imunoglobulinski mucin 3) utiču jedan na drugi kao i na ekspresiju PD-L1 markera. U regulaciji ovih procesa važna je i aktivnost proinflamatornih citokina (TNF-α, IL-6), galektina-9, i sličnih faktora [18]. Detaljna analiza interakcije ovih i sličnih imunih kontrolnih puteva mogla bi dati sveobuhvatnija objašnjenja antitumorskog imuniteta.

Imunohistohemijski metod koji koristi citoblokove veoma je reprezentativan za adekvatno otkrivanje ćelija karcinoma jajnika u peritonealnom lavatu [19]. Ovo bi moglo biti od velikog značaja za pacijentkinje koje nije moguće operisati i kod kojih su dijagnostičke i terapijske opcije ograničene. Izolovanje ćelija karcinoma na taj način moglo bi biti manje invazivno i dovoljno pouzdano za utvrđivanje daljih procedura. Tumorske ćelije u citoblokovima imaju identičnu membransku ekspresiju PD-L1 kao u histološkim uzorcima, što još jednom potvrđuje validnost ovog metoda. Uz upotrebu citoblokova, materijal ispoljava značajnu korelaciju imunohistohemijske ekspresije sa standardnim histološkim preparatima. S obzirom na primenjivost citološkog materijala za interpretaciju ekspresije PD-L1, postojala je prihvatljiva pouzdanost rezultata formiranja citoblokova, za razliku od konvencionalnih citoloških razmaza i liquid-based citologije [20].

Zaključili smo da je učestalost visoke PD-L1 ekspresije veća u tumorskim ćelijama omentuma (87%) nego u primarnom tumoru (60%) i citološkom materijalu (32%). U podudarnim uzorcima, našli smo pozitivnu korelaciju između ekspresije PD-L1 u različitim uzorcima tumora. Dobili smo statistički značajne rezultate koji su sa dovoljno pouzdanosti pokazali PD-L1 ekspresiju na ćelijama karcinoma jajnika HGSC, bez obzira na to da li je analiziran primarni tumor, metastaza, ili citološki uzorak. Ovi rezultati pokazuju mogućnost primene PD-L1 imunohistohemijske analize na različite vrste materijala sa podjednakom pouzdanošću.

Ograničenje ovog istraživanja svakako predstavlja mala veličina uzorka. Imajući u vidu da je reč o prospektivnoj studiji i da su adekvatni citološki uzorci dostupni, smatramo da je ova studija dovoljno značajna da ukaže na dalje slične i još modernije istraživačke projekte u budućnosti. Tumorsko mikrookruženje predstavlja sjajno i neistraženo polje. Poređenje njegovih regulatornih mehanizama i raznovrsnog ponašanja molekula moglo bi da dovede do boljeg razumevanja antitumorskih interakcija kao što je imunosupresija.

ZAKLJUČAK

Ekspresija PD-L1 bila je slična u sve tri posmatrane grupe. Ovo bi moglo da ukaže na slične peritumorske regulatorne mehanizme koji postoje između primarnih tumorskih tkiva i citoloških tumorskih uzoraka. Imajući u vidu dobijene rezultate, mogla bi da bude korišćena manje invazivna procedura, kao što je peritonealno ispiranje, koja bi pouzdano predstavila odlike primarnog tumora. Za potvrdu ovih zaključaka, potrebno nam je u budućnosti još studija.